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Megazyme 淀粉抗性检测试剂盒K-RSTAR说明书

发布日期:2020-04-26    浏览次数:75

 前言

抗性淀粉(RS)是指在人小肠内不能被酶解的淀粉,在大肠部分或完全发酵。RS是总膳食纤维的组分之一。
原理(AOAC法 2002.02 ;AACC法32-40)
   抗性淀粉的测定方法: 样品使用α-胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶(AMG)37振荡水浴孵育16小时,在这期间,通过两种酶的联合作用,非抗性淀粉被溶解,水解成D-葡萄糖,孵育结束后,加入等体积的乙醇或工业甲基化酒精(IMS,变性乙醇)终止反应。离心上述溶液,收集上清勿弃,底部残留絮状团即为样品中的RS,用含水的IMS或乙醇(50%v/v)洗涤絮状团,洗涤后离心,再重复一次洗涤离心,收集离心后获得的上清,与之前收集的上清混合。小心倒出试管残留的液体,将絮状团置于冰水浴中,加入2M KOH溶解,溶解的同时用磁力搅拌机剧烈搅拌。用醋酸盐缓冲液将这个溶液调至中性,用AMG将淀粉定量水解成葡萄糖。D-葡萄糖用葡糖氧化酶/过氧化物酶试剂(GOPOD)测定,这也是对样品中RS含量的测定。非抗性淀粉(可溶性淀粉)的测定可通过集中的上清液并定容至100mL,再用GOPOD测定D-葡萄糖完成。
应用性和精确性
这个方法需要样品中RS含量多于2% w/w。如RS含量多于2% w/w,常规标准误差为+5%。少于2% w/w RS的误差更高。
试剂盒
  瓶子1:淀粉葡糖苷酶AMG,12 mL,3300U/ mL,条件为pH4.5,40℃下,底物为可溶性淀粉,[单位或为200U/mL,条件为pH4.5,40℃下,底物为对硝基苯基β-麦芽糖苷]。AMG溶液应完全没有可检测到的游离D-葡萄糖。4℃下稳定性> 3年。
  瓶子2:α-胰淀粉酶(胰酶,10g,3Ceralpha U/mg)。4℃下稳定性> 3年。
瓶子3:GOPOD 试剂缓冲液。磷酸钾缓冲液(1M,pH7.4),对羟基苯甲酸(0.22M)和叠氮化钠(0.4%W/V)。4℃下稳定性> 3年。
瓶子4:GOPOD试剂酶。葡糖氧化酶(>12,000U)加上过氧化物酶(>650U)和4-氨基安替比林(80mg)。冻干粉,-20℃下稳定性>5年。
瓶子5:D-葡萄糖标准溶液(5 mL,1.0mg/mL)溶于苯甲酸0.2%(w/v)。室温下稳定性>5年。
瓶子6:抗性淀粉对照。抗性淀粉含量如表所示。室温下稳定性>5年。
溶液/悬浮液的制备
1.使用瓶子1中提供的的产品(AMG;溶液1)。这个溶液是有粘性的,因此应使用正向移液器??2ml的,一个(或其他功能相同的装置)移取分装。4℃下稳定性> 3年。
稀释AMG(300 U/ mL。取2 mL瓶子1中的AMG浓缩液用0.1M顺丁烯二酸钠缓冲液(0.1M,pH6.0下面有清楚解释怎么调pH;试剂1,非提供)稀释至22mL。以5 mL为单位分装后用聚丙烯管???冷冻保存。反复冻融不会影响稳定性,稳定性-20℃>5年。
用前制备
2.用100mL顺丁烯二酸钠缓冲液(100mM,pH6.0;试剂1,非提供)悬浮1g???怎么取?瓶子2中的产品(α-胰淀粉酶),搅拌5分钟。加入1.0mL稀释的AMG(300 U/ mL,混匀。>1500g离心10分钟,慢慢倒出上清液,这就是制备的溶液2。溶液2制备后应当天使用
3.用蒸馏水稀释瓶子3中的产品(GOPOD 试剂缓冲液)稀释至1L,这就是制备的溶液3。制备后马上使用全部用,下一步里有
备注:
(1)如果浓缩缓冲液在-20℃下储存,它将形成结晶盐,因此必须要完全溶解才可以用蒸馏水稀释。
(2)这个缓冲液包含0.4%(w/v)的叠氮化钠。因此这是个有毒化学物,应进行相应的处理。
4.取瓶3中制备好的溶液320mL溶解瓶子4里全部的产品,定量转移这个溶液至装有剩余溶液3的瓶子中。用铝箔封盖瓶子以遮光。这就是葡萄糖测定试剂(GOPOD 试剂),可以在2-5℃保存3个月或者-20℃下保存一年。
如果试剂要以冷冻态储存,应分装后再冻存。
当试剂是新鲜制备的,它的颜色应是浅黄色或浅粉色。在4℃储存2-3个月时会演变成深粉色。当以蒸馏水为对照时,这个溶液的吸光度应小于0.05。
5&6.使用瓶子5或6提供的产品。室温下稳定性>5年。
没有提供的试剂(应购买分析纯级)
1.顺丁烯二酸钠(马来酸钠)缓冲液(100mM,pH6.0)加上5mM二水氯化钙和叠氮化钠(0.02%w/v).
用1600mL蒸馏水溶解23.2g顺丁烯二酸,用4M(160g/L)氢氧化钠调节pH至6.0,加入0.74g二水氯化钙和0.4g叠氮化钠,并溶解。定容至2L。4℃下可保存一年。
2.醋酸钠缓冲液(1.2M,PH3.8)
将69.6mL的冰醋酸(1.05g/mL)加至800 mL的蒸馏水中,用4M氢氧化钠调节pH至pH3.8。用蒸馏水定容至1L,室温下可保存一年。
3.醋酸钠缓冲液(100mM,PH4.5)
将5.8mL的冰醋酸加至900 mL的蒸馏水中,用4M氢氧化钠调节pH至4.5。用蒸馏水定容至1L,4℃保存2个月。
4.氢氧化钾溶液(2M)
将112.2gKOH加至900 mL的去离子水中,搅拌溶解。定容至1L,密封保存。室温下可保存2年。
5.含水乙醇(或者IMS)(大约50%v/v)
将500mL乙醇(95%v/v或者99%v/v)或者工业甲基化酒精(IMS;变性乙醇;95% v/v 乙醇加上5%甲醇)至500mL的水中。密封保存,室温下稳定保存>2年。
备注:
一系列包含RS的对照样品0.6%-78%w/w可从Megazyme公司购买。
设备(推荐)
1. 离心式粉碎机,带有齿轮转子和1.0mm筛子,或类似的装置。小型样品可选择旋风磨碎机替代。
2.绞肉机-手动或电动的,装有4.5mm筛。
3.台式离心机-能够放入16×120mm玻璃试管,速度大约1500g(3000rpm)
4.振荡水浴器,可设定为每分钟100次直线运动(振荡速度为每分钟200里程),振荡距离35mm,37℃。
5.水浴锅-能够保持在50+0.1℃。
6.涡旋混匀器。
7.磁力搅拌器。
8.磁力搅拌棒-5×15mm。
9.pH计
10.计时器
11.分析天平(精确到0.1毫克)
12.分光光度计-能够设定510nm(10mm路径长度)
13.100μL移液器及一次性枪头
14.连续分配器-配有50mL管嘴,能够移取2.0mL,3.0mL和4.0mL。
15.培养管-螺旋帽,16×125mm
16.玻璃试管-16×100mm,14mL容量
17.塑料盒,可放置试管架,也可作为冰盒使用。
18.温度计-能够读取37+0.1℃和50+0.1℃。
19.容量瓶-100mL,200mL,500mL,1L,2L
样品制备
用磨碎机研磨大约50g谷物样品或冻干植物或食品,使样品粉末可过1.0mm筛。转移所有的材料至广口瓶,颠倒振荡混匀。工业淀粉一般不用研磨。用绞肉机粉碎鲜样(如罐装的豆子,香蕉,土豆),过4.5mm筛。用AOAC法925.10(15),测定干样中的含水量,根据AOAC法925.10,冻干后烘炉干燥测定鲜样中的含水量。
分析方法
(a)水解和溶液化非抗性淀粉
1.准确称取100mg(±5 mg)样品后直接倒入有螺旋帽的试管里,轻柔的拍打试管以保证样品集中在底部。
注意:对于湿样,样品大概为0.5g(准确称重),这些材料的含水量通常为60-80%。
2.每个试管中加入4.0 mLα-胰淀粉酶(10 mg/mL)其中含有AMG(3 U/mL)(溶液2)
3.盖紧试管盖子,用涡旋振荡器混匀,卧式放入振荡水浴器,与运动方向平行
如下图所示:

 

4.连续振荡,37℃孵育,精确孵育时间为16小时。(备注:200里程/min)
5.把试管从水浴锅中拿出,用纸巾擦掉多余的水。拿开盖子,加入4.0mL乙醇(99% v/v)或者IMS(99% v/v),用涡旋器涡旋。
6.1500g离心,10分钟(不加盖)
7.小心倒出上清,加入2mL 50%乙醇或50% IMS重悬浮,用涡旋器涡旋,再加入6mL 50%IMS,混合,1500g离心,10分钟
8.小心倒出上清,重复上述重悬浮和离心步骤。
9.小心倒出上清,翻转试管,用纸巾吸除多余的液体。
(b)测定抗性淀粉含量
1.将试管冰浴,再向每个试管中加入磁力搅拌棒和2 mL2M的KOH,用磁力搅拌机在冰浴/水浴状态下搅拌20min,以重悬浮絮状物和溶解RS。
如下图所示:
 
备注:
(1)不要使用涡旋器混匀,那将会导致淀粉乳化。
(2)确保边加入KOH溶液边剧烈搅拌试管里的样品。这将会避免形成难溶的淀粉块。
2.向每个试管中加入8 mL1.2M的醋酸钠缓冲液(pH3.8),并用磁力搅拌机搅拌。立即加入0.1mLAMG(溶液1;3300U/mL),混匀,并放入50℃水浴。
3.孵育30min,期间用涡旋器间歇混匀。
4.对于RS含量>10%的样品,用水洗瓶定量转移试管里的样品至100mL容量瓶,当用洗瓶洗涤试管中的溶液时用外磁铁保持试管中的磁力棒。用蒸馏水定容至100mL,并混匀。以单位体积离心溶液,1500g,10min。
5.对于RS含量<10%的样品,直接离心1500g,10min(非稀释)。对于这些的样品,试管里的最终体积大约为10.3mL(体积可能会变化,如果分析的是湿样,在计算数值时应注意折扣)
6.将稀释的(4.)或非稀释的(5.)上清液以0.1mL为单位转移至玻璃试管(16×100mm),一式两份,加入3.0mLGOPOD试剂(溶液4),50℃孵育20分钟。
7.测量每一个溶液的在510nm下相对于空白试剂的吸光度值。
制备空白试剂
准备空白试剂:通过混匀0.1mL的100mM的醋酸钠缓冲液(pH4.5)和3.0mL的GOPOD试剂
制备D-葡糖糖标准品(一式四份)通过混合0.1mLD-葡萄糖(1mg/mL)和3.0mL的GOPOD试剂制备D-葡糖糖标准品。
(c)计算非抗性(可溶性的)淀粉
1.收集起始孵育[(a)7.]过程中离心获得上清液和两次50%乙醇洗涤[(a)8.和9.]获得的上清液至容量瓶中。用100mM的醋酸钠缓冲液(pH4.5)定容至100mL。混匀。
2.以0.1 mL为单位孵育溶液(一式两份)并加入10μL稀释的AMG溶液(300U/mL), 50℃孵育20分钟,加入3.0 mL GOPOD试剂(溶液4),50℃孵育20分钟。
3.计算在510nm下相对于空白试剂的吸光度值。
4.计算非抗性淀粉的含量。
计算
计算样品中抗性淀粉含量,非抗性淀粉含量和总淀粉含量(%,在干重的基础上),计算模板如下:
抗性淀粉(g/100g样品)(样品包含>10%RS)
 
=⊿E×F×100/0.1×1/1000×100/W×162/180
=⊿E×F/W×90
抗性淀粉(g/100g样品)(样品包含<10%RS)
=⊿E×F×10.3/0.1×1/1000×100/W×162/180
=⊿E×F/W×9.27
非抗性淀粉含量(g/100g样品)
=⊿E×F×100/0.1×1/1000×100/W×162/180
=⊿E×F/W×90
总淀粉含量=抗性淀粉含量+非抗性淀粉含量
⊿E=相对于空白试剂的吸光度值
F=从吸光度值到微克的转换(在GOPOD反应中100μgD-葡萄糖的吸光度值是确定的,F=100(D-葡萄糖的μg数)除以这100μgD-葡萄糖的GOPOD吸光度值)
100/0.1=体积校正(从100mL取0.1mL
1/1000=从微克到毫克
W=分析样本的干重
      =重量×(100-含水量/100
100/ W=RS在样品重量中百分比因子
162/180=从测定获得的游离D-葡萄糖转换到淀粉中存在的脱水-D-葡萄糖的因子
10.3/0.1=体积校正(从10.3 mL取0.1mL),对于含有0-10%RS,当孵育溶液时没有被稀释,最终体积为-10.3 mL。当分析湿样时,体积会增大,在计算时应计算折扣。
表1.使用试管内分析方法获得的RS值与活体结果的比较

 

淀粉来源
 
RS(试管内分析方法/结果)a
RS(活体)
Englyst
Faisant
Champ
McCleary
 
Gonib
 
马铃薯淀粉(土著)
66.5
83.0
77.7
77.0
-
78.3
高直链淀粉玉米淀粉(土著)
71.4
72.2
52.8
51.7
-
50.3
高直链淀粉玉米淀粉(退化)
30.5
36.4
29.6
42.0
37.8b
30.1
豆片
10.6
12.4
11.2
14.3
 
15.3c
9-10.9
玉米片
3.9
4.9
4.3
4.0
 
4.7c
3.1-5.0
罐装豆子
17.1
-
17.1
16.5
-
16.5
ActiStard
63d
-
57d
58.0
57d
 
54d