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Megazyme 葡萄糖淀粉酶的活力测定

发布日期:2020-04-26    浏览次数:160

 【摘要】糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基,能被次碘酸钠氧化,过量的次碘酸钠酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液滴定,计算酶活力。1g固体酶粉(或1ml液体酶),于40℃、pH值为4.6的条件下,1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖,即为1个酶活力单位,以u/g(u/ml)表示。

【关键词】     葡萄糖     淀粉酶    活力测定     酶活力
【引言】酶作为生物体内催化剂,测定其活力是非常有必要的。不同种类的酶的活力测定方法不同。按照淀粉酶水解淀粉的作用方式,可以分为α-淀粉酶和β-淀粉酶等。根据其催化产物的特点和现有测定方法规定酶活力单位为:每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数,来对这两种酶进行有效的测定。两种酶作用淀粉的方式不同。α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键,生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖,同时使淀粉的粘度降低,因此又称为液化酶。β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解,每次水解下一分子麦芽糖,又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原,生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线,用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量,以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
【正文】
一.实验原理:葡萄糖淀粉酶(糖化酶)在一定的条件下能水解生成葡萄糖,葡萄糖的醛基被弱氧化剂次碘酸钠氧化。过量的碘用硫代硫酸钠滴定。从碘的减少量计算葡萄糖的量,从而计算酶活力。
二.试剂与材料:
1.2%可溶性淀粉液:称取可溶性淀粉2g,以少许蒸馏水调匀,侵入80ml的沸水中,继续煮至透明状,冷却后,加水定容至100ml
2.PH4.6,0.1mol/L醋酸缓冲液:0.1mol/L苏酸溶液与0.1mol/L醋酸钠溶液等体积混合。
3.0.1mol/L碘液:称取36g碘化钾,溶于100ml蒸馏水中,加入14g碘,逐渐溶解,加3滴盐酸,定容至1000ml
4.0.1mol/L氢氧化钠溶液:称取4g NAOH,用水溶解,定容至1000ml
5.1mol/L硫酸溶液。量取56ml浓硫酸,倒入适量水中,用水稀释至1000ml
6.0.05mol/L硫代硫酸钠溶液:称取25g硫代硫酸钠,0.2g碳酸钠,溶于1000ml煮沸冷却后的水中,存于棕色瓶。放置一周后,用0.1mol/L重络酸钾滴定。
7.0.5%淀粉指示剂:称取0.5g可溶性淀粉用少量水调匀。倒入80ml沸水中,继续煮至透明,冷却后,定溶100ml
三.实验步骤:
    1.吸取2%可溶性淀粉液10ml,加入PH4.6醋酸缓冲液5ml,混匀后于40℃水浴中预热10min
2.加入酶液1ml,于40℃,反应10min。反应结束时,沸水中煮10min,以终止酶反应。
3.吸取上述反应液5ml于碘量瓶中,加入0.1mol/L碘液5ml及0.1mol/L NAOH溶液5ml,混匀,于室温下暗处放置15min,加入2mol/L硫酸酸化。
4.以0.5%可溶性淀粉液作为指示剂,用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至蓝色消失为终点。记录0.05mol/L硫代硫酸钠消耗的毫升数(A),以及空白试验消耗的硫代硫酸钠毫升数B
四.结果计算:
在上述条件下,每小时催化淀粉水解生成1mg葡萄糖的酶量定义为一个酶力单位。
               酶活力=(B-A)×c×90.05×16/5×60/10
式中,B=空白试验消耗的硫代硫酸钠的毫升数   ML
  A=测定时消耗硫代硫酸钠的毫升数   ML
  c=硫代硫酸钠的摩尔数   MOL
   90.05为葡萄糖的毫克当量
酶活力=
      =
 
硫代硫酸钠溶液的标定。
准确称取0.1g重络酸钾,放入500ml碘量瓶中,加20ml水溶解,加1.8g碘化钾,15ml2mol/L盐酸溶液,混匀,盖好,暗处反应10min,加约200ml水稀释,立即用0.05mol/L硫代硫酸钠溶液滴定至浅黄色,加约1ml 5%可溶性淀粉指示剂,继续滴定至蓝色消失,溶液呈绿色。
五.实验结果分析:
⒈酶活力测定实验的总体思路应该是什么?
答:没活力测定实验中都是根据酶活力的大小与催化产物的量成正比来计算酶活力大小的。
⒉由上述总体思路认为酶活力测定实验中最关键的设计应该是什么?为什么?在该项设计中要注意什么?
答:在酶活力测定实验中,最关键的有3点:测定酶促反应初速度、在最适条件下测定酶促反应速度以及底物浓度要远超酶量。因为在酶促反应初期,产物浓度随反应进程成正比例增加,随着反应时间的延长,产物浓度的增加使逆反应速度增加、生成产物会对酶活力产生抑制、部分酶分子失活,所以要准确测定酶活力,应该测定产物浓度随时间呈线性增加时间段的速度;其次,要在最适条件下测定酶促反应速度,酶的本质一般是蛋白质,过酸、过碱以及温度过高都会使酶变性,而且,溶液中的离子种类和离子强度对酶活性和酶溶解度都会有一定影响,应该选择适合的缓冲液。最后,酶活测定实验中,必须提供足够的底物,是所有的酶处于饱和状态。
3.酶促反应的特点?规定酶活力单位的作用?酶活力单位想表征的内涵是什么?其规定有什么特点?
答:酶促反应的特点一是通过显著降低反应活化能,提高催化效率;二是对催化反应具有高度专一性;三是酶促反应条件温和,可以在常温、常压和有水的条件下正常进行;此外,在生物体内,酶的活性受到严格调节。规定酶活力单位可以表示酶催化能力即酶活性的大小。
酶活力单位想表征的内涵是单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量。其规定特点为以酶促反应产物的生成速度来间接反应酶活力的大小。
4.所有酶活力测定方法中都有所谓的“对照管”的设计,为什么?其作用是什么?在对它的设计上有何特点?
答:对照管用于测定反应过程中酶量的变化,其设计特点就是在碱性条件下保持其活性。
参考文献
    《酶工程》(第三版),郭勇编著,科学出版社,2009.
《现代生化技术》,郭勇编著,华南理工大学出版社1996.8(2006.12重印)